دانلود پایان نامه ارشد درمورد انتروکوکوس، آنتی، انتروکوکوس، فکالیس

ی سنی که در پژوهش حاضر مورد ارزیابی قرار گرفتند. 80
شکل ‏4-7: نتایج مربوط به گروه های سنی نمونه های انتروکوکس فکالیس 81
شکل ‏4-8: نتایج حاصل از وضعیت گروههای سنی در ارتباط با نمونههای انتروکوکوس فاسیوم 81
شکل ‏4-9 : تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی به روش دیسک دیفیوژن. از انتروکوکوس فکالیس ATCC29212 نیز به عنوان کنترل منفی استفاده گردید 82
شکل ‏4-10: از مجموع تمام نمونه های انتروکوکوس فکالیس بدست آمده، تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی به روش دیسک دیفیوژن صورت پذیرفت. از انتروکوکوس فکالیس ATCC29212 نیز به عنوان کنترل منفی استفاده گردید 82
شکل ‏4-11: مقاومت آنتی بیوتیکی انواع نمونه ها به جنتامایسین 84
شکل 4-12: مقاومت آنتی بیوتیکی انواع نمونه ها به استرپتومایسین 85

فهرست جداول
جدول ‏4-1: پرایمرهای استفاده شده در این مطالعه برای پیدا کردن سویه‌های مقاوم به آمینوگلیکوزید 69
جدول ‏4-1: نتایج مربوط به جنسیت نمونه های مثبت بدست آمده. مشخص شده است. 80
جدول ‏4-2: نتایج بررسی مقاومت افزایش یافته به جنتامایسین و استرپتومایسین برای انتروکوکوس فکالیس 83
جدول ‏4-3: نتایج بررسی مقاومت افزایش یافته به جنتامایسین و استرپتومایسین برای انتروکوکوس فاسیوم 83

چکیده
زمینه وهدف: انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم با توانمندی بالا در ایجاد بیماریهای عفونی مانند اندوکاردیت، عفونت ادراری و مننژیت هستند. توانمندی بالای آنها برای کسب ژنهای مقاومت به آنتی بیوتیک، درمان آنها را با مشکلات جدید مواجه کرده است. هدف از این مطالعه بررسی مقاومت افزایشی انتروکوکوس فکالیس و فاسیوم به آنتی بیوتیک های آمینوگلیکوزیدی بوده است.
مواد و روش ها: 100 نمونه انتروکوک از آزمایشگاه بالینی نور تهران، پس از جمع آوری با استفاده از تست های بیوشیمیایی معمول، شناسایی شدند. برای سویه‌های جدا شده تست تعیین حساسیت گونهها به آنتی بیوتیکهای آمینوگلیکوزیدی با غلظتهای افزایش یافته جنتامایسین 120 میکروگرم و استرپتومایسین 300 میکروگرم و همین طور دیگر آنتی بیوتیکهای آمینوگلیکوزیدی با استفاده از روش دیسک دیفیوژن انجام شد. در نهایت به منظور شناسایی مولکولی مقاومت، حضور 6 ژن عامل ایجاد مقاومت با استفاده از روش Multiplex PCR بررسی شدند.
نتایج: از 100 ایزوله، 84% انتروکوکوس فکالیس و 16% انتروکوکوس فاسیوم بودند. با روش دیسک دیفیوژن مشخص گردید 56% از نمونهها به هر دو آنتیبیوتیک جنتامایسین و استرپتومایسین با غلظتهای افزایش یافته مقاوم بودند. همچنین بیشترین مقاومت به تتراسایکلین مشاهده شد و ژن مقاومت در ایزولههای ادرار بیش از بقیه نمونهها وجود داشت. در این مطالعه 18 سویه به ونکومایسین نیز مقاوم بودند. نتایج PCR نشان داد حضور ژنهای aac(6′)-Ie-aph(2″)-Ia ، ant(4′)-Ia و aph(3′)-IIIa به ترتیب 60% ، 30% و 50% بودند. 9 ایزوله هر سه ژن را داشتند. همچنین ژنهای aph(2”)-Ib ، aph(2”)-Ic و aph(2”)-Id شناسایی نشدند.
بحث: به دلیل وجود مقاومت دارویی در انتروکوک پیشنهاد میشود از روشهای مولکولی مانند PCR برای تشخیص سریع و نهایی مقاومت در کنار روشهای دیسک گزاری استفاده شود. تشخیص درست، سریع و قطعی، تنها راه جلوگیری از افزایش مقاومت به آنتی بیوتیکها و گسترس پدیده HLAR است.

کلمات کلیدی: انتروکوکوس فکالیس، انتروکوکس فاسیوم، مقاومت آنتی بیوتیکی، آمینوگلیکوزید، MultiplexPCR

فصل اول
کلیات

کلیات
1-1- مقدمه
انتروکوکها کوکسیهای گرم مثبتی هستند که اگر چه به طور معمول فلور نرمال دستگاه گوارش انسان و حیوانات محسوب میشوند، ولی امروزه آنها به عنوان عامل مهم عفونتهای بیمارستانی مطرح هستند (1). این باکتریها به علت کسب مقاومتهای چندگانه به انواع آنتی بیوتیکها، به عنوان یکی از مشکلات درمانی محسوب می‌شوند. از جمله مقاومتهایی که در انتروکوکها ایجاد شده است میتوان به مقاومت نسبت به دوزهای بالای آمینوگلیکوزیدها، بتالاکتامها و گلیگوپپتیدها اشاره کرد و از آنجائی که معمولاً ونکومایسین به عنوان آخرین راه حل درمانی برای سویه‌های مقاوم به چند دارو استفاده میشود (2)، بنابراین مقاومت به ونکومایسین در بین سویه‌های انتروکوکی دارای اهمیت به سزایی است، مقاومت به آمینو گلیکوزیدها نیز به دلیل شکست درمانی در سینرژی یک داروی موثر بر دیواره باکتری (مثل پنی سیلین) و آمینو گلیکوزیدها، مشکل دیگری را در درمان آنها ایجاد کرده است (3)، خصوصاً اینکه، این مقاومتها میتوانند توسط عناصر ژنتیکی مختلفی مثل ترانسپوزونها و پلاسمیدها بین گونههای انتروکوکی و حتی بین جنسهای باکتریایی منتقل شوند و در نتیجه طیف وسیعی از باکتریها را درگیر کنند (4).
حضور ژنهای مقاومت برروی کروموزم باکتریایی و یا پلاسمیدی میتوانند مقاومت به چندین آنتیبیوتیک خانواده آمینوگلیکوزیدی را ایجاد کند. بنابراین تعیین فراوانی ژنهای مقاومت به آمینو گلیکوزیدها میتواند در انتخاب یک رژیم درمانی مناسب، موثر باشد (5).
انتروکوکها که سالیان متوالی، تنها به عنوان فلور غیربیماریزای دستگاه گوارش انسان و حیوانات محسوب میشدند، در طول دو دهه گذشته، به سبب نقش موثری که در ایجاد عفونت‌های بیمارستانی داشته و استعداد ویژهای که در کسب مقاومتهای چندگانه نسبت به انواع آنتی بیوتیکهای مرسوم نشان داده اند، به شدت مورد توجه قرار گرفتها
ن
د (6, 7).
از انواع مقاومتهایی که نسبت به آنتی بیوتیکهای مختلف در انتروکوکها مشاهده میگردد میتوان به مقاومت نسبت به دوزهای بالای آنتی بیوتیکهایی از خانوادههای بتالاکتامها ( (8)، گلیکوپپتیدها (9) و آمینوگلیکوزیدها (10) اشاره نمود.
درباره اهمیت مقاومت به دوزهای بالای آمینوگلیکوزیدها کافی است بدانیم درمان عفونتهای سیستمیک چون اندوکاردیتها (11)، باکتریمی (12)و مننژیت (13) تنها در حضور رژیمهای درمانی که حاصل ترکیب آنتیبیوتیکی با این گروه دارویی است، امکان پذیر می‌باشد. آمینو گلیکوزیدها به جهت مشاهده مقادیر روزافزون مقاومت به دوزهای بالای آنها و نقش موثری که عناصر ژنتیکی متحرک خارج کروموزمی همچون پلاسمیدها در گسترش این نوع از مقاومتها بر عهده دارند، از جایگاه ویژهای برخوردارند (14). امروزه، دستیابی و بکارگیری بهترین، مطمئن ترین و سریعترین روش به منظور تشخیص حضور این نوع مقاومت، تعیین مقادیر MIC1 آنها و نیز یافتن علل انتشار و پراکندگی آنها و در آخر قضاوت پیرامون کارا بودن و یا عدم کارایی این خانواده آنتی بیوتیکی در رژیمهای دارویی، از مهمترین وظایف آزمایشگاههای مرجع، تشخیص طبی و بیمارستانها می‌باشد.
1-2- بیان مسئله
انتروکوکوس شامل کوکسی گرم مثبت و کاتالاز منفی است، که تا کنون 19 گونه آن شناسایی شده‌اند. اما فقط 2 گونه از آن یعنی انتروکوکوس فکالیس وانتروکوکوس فاسیوم عامل اصلی در عفونتهای انسانی می‌باشند. این دو گونه یکی ازشایعترین عوامل عفونتهای بیمارستانی نیز محسوب میشوند که اطلاق نام انتروکوک به دلیل توانایی حضور آنها در روده میباشد و در ضمن این گروه یکی از مقاومترین گروه باکتریها در مقابل آنتی بیوتیکها میباشند (15).
یکی از دلایل اصلی نقش آنها در عفونت بیمارستانی مقاومت ذاتی این باکتری به چندین آنتی بیوتیک مورد بیمارستان دیده استفاده می‌باشد و مهم‌تر اینکه شاید توانایی آنها برای دریافت مقاومت به تمام آنتی‌بیوتیک‌ها به دلیل قدرت دریافت اجزای خارجی ژنتیکی ازطریق پلاسمید است. همچنین ایجاد مقاومت میتواند از طریق موتاسیون صورت گیرد؛ که منجر به ایجادانتروکوکهای مقاوم به وانکومایسین می شود. کنترل این دسته بسیار مشکل شده است (16, 17)

روش‌های کشت به 24 تا 48 ساعت زمان نیاز دارد، تا باکتری رشد کرده و تعیین هویت شده و آزمایش تعیین حساسیت برای آن انجام شود(18). در بعضی از موارد سرعت عمل می‌تواند جان بیمار را نجات دهد، لذا استفاده از روش مولکولی مولتی پلکس PCR جهت تشخیص باکتری‌های عامل عفونت می‌تواند مفید باشد (19, 20).

1-3- انتروکوکها2
1-3-1- طبقه بندی
واژه انتروکوک توسط ت? ?ر س?ل?ن 3 درسال 1899 برای توص?ف ارگان?سم های کوچک?4 که به صورت جفت ?ا زنج?رههای کوتاه در مدفوع د?ده شدند، انتخاب شد. مشاهدات اول?ه در مورد خصوص?ات رنگ آم?زی گرم، شکل، آرا?ش سلول? و فقدان کاتا?ز، انتروکوک ها را به? عنوان اعضاء جنس استرپتوکوک معرف? نمود. با گسترش س?ستم گروه بندی ?نسف?لد5 در سال 1933، انتروکوکها از نظر آنت? ژن اختصاص? در گروه D?قرار گرفتند (21). ربکا لانسفیلد رده بندی جدیدی را پیشنهاد کرد. وی دریافت که اگر استرپتوکوک را در محیط کشت مایع با اسیدیته قوی ( pH=2) قرار داده و به مدت 10 دقیقه در گرمای C0 100 نگه دارند ماده آنتی ژن محلولی از جنس هیدرات کربن از دیواره باکتری خارج می شود که آن را، کربوهیدرات C نامید، و بر اساس این آنتی ژن آنها را به گروه های A تا E تقسیم بندی کرد. تمام اعضای جنس انتروکوک با آنتی سرم گروه D لانسفیلد واکنش میدهند (22, 23(.
در سال 1906 نام انتروکوکوس فکالیس? توسط اندرو و هوردر6 برای ارگان?سم? با منشأ مدفوع? که توانا?? انعقاد ش?ر، تخم?ر مانت?ول و ?کتوز و عدم توانایی تخم?ر راف?نوز را داشت بکار برده شد (23(.
جنسون7، انتروکوکوس فاس?وم را که از نظر الگوی تخم?ری متما?ز از نتروکوکوس فکال?س بود را شرح داد (24, 25(.
استرپتوکوکوس دورانس8 توسط و وینگ که مشابه با استرپتوکوکوس فاسیوم با فعالیت تخمیری کمتر معرفی گردید، اما جنسن انتروکوکوس نخستین بار در سال 1984 توسط چلیپر و کلیفر ا از استرپتوکوکوها جدا شد. جنسن انتروکوک فقط دارای آنتی ژن گروه D است که جزء فلور نرمال دسگاه گوارش انسان میباشد. سایر گونهها که آنتیژن گروه D را دارند قسمتی از فلور نرمال روده را تشکیل میدهند و استرپتوکوکهای گروه D میباشند (26، 27)
امروزه اما این جنس، گونه‌های متعددی را در خود جای می‌دهد که تعداد آنها در منابع مختلف از 17 تا 21 گونه متغیر بوده (23, 26) و در 5 گروه قرار می‌گیرند (26) . شایع‌ترین آنها دو گونه، E. faecium وE. faecalis هستند. اما گزارش‌هایی به ندرت مبنی بر مشاهده سایر گونه‌ها در عفونت‌های انسانی دیده شده است که از انواع این‌گونه‌ها می‌توان به E.durans، E. flavescens, E. munstii, E. gallinarum, E. avium, E. casseliflavus, E. raffinosus و E.hirae اشاره نمود (22, 26, 27). حضور این‌گونه‌ها در مناطق مختلف دنیا متفاوت بوده است. به عنوان مثال در مواردی دو گونه E. gallinarum , E. casseliflavus. غالب‌ ترین انواع پس از E. faecalis وE. faecium گزارش شده است (28).
1-3-2- خصوصیات بیولوژیک ?
انتروکوکها، گرم مثبت ب?هوازی اخت?اری و کاتا?ز منف? هستند قادرند? در مح?ط حاوی 5/6% کلرید سدیم، 40 % صفرا رشد میکنند. آنها معمولاً در pH محدوده ( 6 الی 9) و در دمای C0 45-10رشد می‌کنند. انتروکوکها در C0 60، 30 دقیقه زنده میمانند. اما رشد بهینه آنها در C0 37مشاهده می‌گردد. این باکتری‌ها همچنین توانایی رشد در NaCI 6.5%, pH=9.6 و ن
مکهای صفراوی را داشته و اغلب آنها قادر به هیدرولیز پیروات می‌باشند (29, 30). اعضای این گروه به راحتی قادر به رشد بر روی محیط (Blood Agar) BA بوده و غالباً قادر به لیز گبلولهای قرمز نمیباشند (همولیز ?) اما انواع آلفا (?) و بتا (?) نیز در میان آنها مشاهده می‌گردد (31). به طوری که نوع ? در میان 10 گونه از انواع انتروکوکها دیده می‌شود. این باکتری‌ها قادرند به راحتی شرایط سخت محیطی را تحمل کنند (32). لذا هر جایی در طبیعت، از جمله خاک، غذا، آب، حیوانات، پرندگان و حشرات قابل جداسازی هستند (33).????????????????
انتروکوکها، کموارگانوتروف9 با متابولیسم جور تخمیر بوده و دامنه وسیعی از کربوهیدرات‌ها را تخمیر می‌کنند که محصول عمده این فرایند اسیدلاکتیک است و هیچ گازی تولید نمی‌گردد.
این باکتریها فاقد آنزیمهای سیتوکروم هستند، اما گاهی اوقات تولید کاتالاز کاذب میکنند . تقریباً همه سویه‌ها هموفرمانتات?و10 بوده و از تخم?ر گلوکز، اسیدلاکتیک تول?د? می‌کنند. آنت? ژن ،D? ?ک گل?سرول ت?کوئ?ک اس?د مرتبط با دیواره سلولی است کهدرهمه سویهها وجود دارد. درصد گوان?ن + سیتوز?ن آنها 37-45 درصد می‌باشد (34). ????????????????
1-3-3- تقسیم‌بندی مولکول?
بر اساس توالی 16SrRNA گونههای انتروکوک در چندین گروه قرار گرفته اند(35)

???
1. گروه انتروکوکوس فکال?س11: شامل انتروکوکوس فکال?س، هموپراکس?داز و موراونس?س.??
2. گروه انتروکوکوس فاس?وم12: شامل انتروکوکوس فاس?وم، دورانس، ه?ره، موندت?، پورک?نز و? و?لوروم.??
3. گروه انتروکوکوس آو?وم13: شامل انتروکوکوس آو?وم، پسودواو?وم، مالودوراتوس وراف?نوزوس .?
4. گروه انتروکوکوس کاسل? ف?ووس14: شامل انتروکوکوس کاسل? ف?ووس، گال?ناروم، ف?وونس??
5. گروه انتروکوکوس سکوروم15: شامل انتروکوکوس سکوروم و کلومبا.??
6. گروه انتروکوکوس د?سپار16: شامل انتروکوکوس د?سپار و اس?ن?.??
7. گروه ساکارول?ت?کوس17: شامل انتروکوکوسساکارول?ت?کوس، سولفوروس??

1-3-4- شناسا?? انتروکوکوس فکالیس
گونههای انتروکوک را بر اساس توانا?? تشک?ل اس?د در مح?ط حاوی مان?تول و سوربوز? براث و ه?درول?زآرژ?ن?ن به پنج گروه تقسیم‌بندی کرده‌اند (35).
گروه اول توانا?? تشک?ل اس?د در مح?ط مان?تول براث و ه?درول?ز آرژ?ن?ن را داشته اما? سوربوز منف? می‌باشند. انتروکوکوس فکالیس در این دسته قرار می‌گیرد. این‌گونه مسئول 90-85 % عفونت‌های انتروکوک? انسان است. ع?وه بر? روده انسان، در دستگاه گوارش مرغ، گوساله، خوک، اسب، گوسفند و بز ن?ز ?افت می‌شود. وجه? تما?ز آن از د?گر اعضا گروه 2، منف? بودن تست آراب?نوز است. تعدادی از وار?انتهای آن قادر? به تحمل تلور?ت و استفاده از پ?رووات می‌باشند.?
گروه دوم توانا?? تشک?ل اس?د در مح?ط حاوی مان?تول و سوربوز براث را داشته اما فاقد? توانا?? ه?درول?ز آرژ?ن?ن می‌باشند.
گروه سوم آرژ?ن?ن را ه?درول?ز کرده اما در مح?ط مانت?ول براث و سوربوز اس?د? تشک?ل نمی‌دهند. – واریانتهای مان?تول منف? انتروکوکوس فکال?س در این گروه قرار دارند. در وار?انتهای غ?ر شا?ع? انتروکوکوس فکال?س که مان?تول منف? و پ?روات مثبت

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *