دانلود پایان نامه ارشد درمورد انتروکوکوس، سویه، بررسی، سویه‌های

امروزه از این روش در شناسایی پاتوژنها، اسکرین جنسیت، آنالیز Linkage، مطالعات جرم شناسی، بررسی کیفیت و کمیت نمونه ها و تشخیص بیماریهای ژنتیکی استفاده میگردد. بطورکلی در شناسائی پاتوژنها، مولتی پلکس PCR باکتریها نشان دهنده یک پاتوژن خاص در میان دیگر باکتریها یا تمایز گونه ها یا سویهها در یک جنس می‌باشد. در مولتی پلکس PCR صرف زمان و معرف نسبت به PCR معمولی که در چندین لوله انجام میشود کمتر می‌باشد به همین دلیل واکنش مولتی پلکس برای استفاده کم از آنزیم و الگوها بسیارمناسب است (96).
1-8-2- طراحی و اجرای Multiplex PCR
در مولتی پلکس PCR میتوان دو مجموعه از پرایمرها که شرایط واکنش آنها بطور جداگانه ارزیابی شده است را با هم مخلوط کرد. هرچند در بعضی مولتی پلکس PCR با توجه به ملاحظات دقیق برای نواحی که آمپلی می‌شوند، اندازه نسبی قطعات، دینامیک پرایمرها و بهینه کردن تکنیک PCR با چندین قطعه مناسب تغییراتی داده شده است. مانند تمام انواع PCR باید در مولتی پلکس PCR اهداف را مشخص کرد و با توجه به آنها پرایمرها را طراحی نمود. این پرایمرها بایستی دارای کنتیک واکنش مشابهای باشند، مقدار C/G پرایمرها حدود 60-40%، طول آنها 28-23 نوکلئوتید و درجه حرارت annealing متوسط داشته باشند. درجه حرارت annealing اولیه و غلظت مواد باید ابتدا ارزیابی شوند، هرچندکه این شرایط را می توان در مولتی پلکس PCR بصورت تجربی بدست آورد. به همین دلیل شرایط برای هر مجموعه پرایمر می بایستی بطور جداگانه طراحی شود و اگر در مجموعه های پرایمر نیاز به اصلاح بود تغییرات اعمال گردد (152-154)
جفتهای پرایمر در هنگامی که جدا کار می‌کنند مشکلی ندارند، ولی وقتی به صورت ترکیبی بکار می روند مشکل بوجود میآید که برای رفع مشکلات می توان از اتانول مناسب در استات سدیم3/0 مولار استفاده کرد. احتمال تشکیل جفت های غیراختصاصی و آرتیفکت ها در اضافه کردن هر مجموعه پرایمر افزایش پیدا میکند. برای رفع باندهای نامناسب مولتی پلکس PCR می توان ازhot-start PCR، اضافه کردن مواد آلی، بالا بردن درجه حرارت annealing استفاده کرد و همچنین اگر از موارد فوق استفاده شد و باندهای نامناسب هنوز وجود داشت بایستی پرایمر جدید طراحی شوند (155, 156).
اگر در غلظت های مولار محصول بدست نیامد و برای همه قطعات آمپلی فیکاسیون صورت نگرفت، بایستی غلظت بعضی از جفت پرایمرها را کاهش داد. این تغییر به خصوص در نمونه هائی که یک هدف بیش از دیگر اهداف دارند مفید می‌باشد. ارتباط معکوسی بین غلظت الیگونوکلئوتید مورد نیاز در مولتی پلکس PCRو مقدار ATP آنها وجود دارد، اما ارتباطی بین موارد فوق با طول الیگونوکلئوتید و Tm وجود ندارد.
هنگامی که بین همه جفت پرایمرها سازگاری وجود ندارد، بایستی آنها را در چندین واکنش مولتی پلکس PCRکوچکتر بررسی کرد. مثلاً در یک پژوهش در ابتدا 18 جفت پرایمر و سپس با اپتیمایز کردن شرایط واکنش با 26 جفت پرایمر برای شناسائی ژن دیستروفی در مولتی پلکس PCR استفاده گردیده است(155, 156).

1-8-3- تیتراسیون اجزای واکنش:
در PCR به خصوص در مولتی پلکس PCR ضروری است که غلظتهای مختلف اجزای واکنش برای بدست آوردن بالاترین کارآئی روش PCR با همدیگر متناسب شوند. غلظت Mg2+ و dNTP و آنزیم پلی مراز اغلب روی تعداد آمپلی کون در مالتی پلکس اثر میگذارند، لذا مانند روش PCR معمولی، غلظت ها بایستی بهینهسازی شوند، چراکه جفت پرایمرها ممکن است دارای نیازمندیهای متفاوت باشند. سیستم های بافری بطور خیره کننده در آمپلی فیکاسیون موثر هستند. از DMSO میتوان به عنوان بازدارنده یا اجزای مفید در مولتی پلکس PCRاستفاده کرد. مواد افزودنی که سبب کاهش باندهای غیر اختصاصی در مولتی پلکس PCR می شود عبارتنداز: توئین20، تریتون 100-X،? مرکاپتواتانول و کلرید تترامتیل آمونیم (155, 156).

1-8-4- شرایط ترموسایکلر:
پارامترهای ترموسایکلر با سکانس مجموعههای پرایمر تعیین میشود. عموماً هرچه تعداد اهداف بیشتر باشد زمان بیشتری باید برای انجام PCRدر نظر گرفته شود. هرچند که در اینجا بایستی این نکته را در نظر داشت که هرچه زمانannealing و extension طولانیتر شود فرصت برای آمپلی فیکاسیون غیراختصاصی هم افزایش مییابد (155, 156).
1-9- تعریف واژهها
1. عفونت ادراری: حضور بیش از 106 باکتری در هر میلی لیتر ادرار
2. مقاومت آنتی بیوتیکی (حساسیت دارویی): (MIC) حداقل غلظت لازم برای رشد باکتری
3. PCR یا واکنش زنجیره ای پلیمراز با دستگاه Thermo cycler انجام میشود که شامل مراحل زیر است:
1. Denaturation: باید دو رشته مورد نظر از هم جدا شوند که به مدت 3 دقیقه در دمای 94 تا 95 درجه سلسیوس صورت میگیرد.
2. Annealing: جفت شدن ژنها با پرایمر مورد نظر است که به مدت 3 دقیقه در دمای 55 تا 60 درجه سلسیوس انجام میشود پرایمرها از قبل توسط نرم افزار طراحی پرایمر و بر اساس ژنهای مورد نظر طراحی میشود
3. Extension: پلیمریزاسیون با کمک DNA پلیمراز به مدت 3 دقیقه در دمای 72 درجه سلسیوس است.
4. Final extension: در دمای 72 درجه سلسیوس به مدت 10 دقیقه انجام میشود

فصل دوم
( مبانی و تاریخچه)

مروری بر منابع
در گروه میکروب شناسی علوم پزشکی ایلام دکتر محمدی به همراه دیگر همکاران در تابستان سال 1390 به بررسی فراوانی مقاومت دارویی گونههای انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم برروی سویه‌های مقاوم به آنتی بیوتیک ونکومایسین با روش PCR پرداختند (157). در طی این مطالعه ان
ت
روکوکهای مقاومی به تعداد زیادی از آنتی بیوتیکها یافت شد. که خود عاملی در شکل گیری عدم درمان مناسب با آنتی بیوتیکها بود. در این بررسی مشخص شد حضور ژنهای VanAوVanB در انتروکوکها در ارتباط با مقاومت به غلظت بالای ونکومایسین می‌باشد.که در بین 12 سویه از انتروکوکها ژنA Vanدیده شد در حالیکه ژن VanB در هیچکدام از سویه ها مشاهده نشد.و مشخص گردید که ژن VanA مهم ترین عامل در شکل گیری مقاومت به ونکومایسین نسبت به ژن VanBمیباشد (157).
در سال 1386 گروهی ازمحققین به سرپرستی دکتر فاتح رحیمی دکتر مهناز سیفی انیستیتو پاستور ایران به بررسی کلونالیتی سویه های انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فیسیوم مقاوم به مقادیر بالای جنتامایسین جدا شده از فاضلابهای شهر تهران جمع آوری شده بود. در این بررسی مشخص شد که سویه‌های انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم چند مقاومتی دارای ژنهای aac(6)Ie_aph(2)Ia هستند که این ژن ها به مقادیر بالای جنتامایسین مقاوم میباشند. در نتیجه مشخص شد که این دو ژن از ژنهای مهم در ایجاد مقاومت انتروکوکی به جنتامایسین میباشند (178).
در سال 1387 دکتر قاسمی و همکارانش در گروه میکروب شناسی در دانشکده علوم پزشکی کاشان به بررسی مقاومت چند دارویی در سویه‌های انتروکوکوس فکالیس جدا شده از نمونههای بالینی در بیمارستان شهید بهشتی و زایشگاه شبیه خوانی کاشان پرداختند. که این مطالعه به طور توصیفی بر روی 106 سویه انتروکوکوس فکالیس انجام پذیرفت (179). تست تعیین مقاومت آنتی بیوتیکی را با روش دیسک دیفوژن و طبق دستورالعملclinic and laboratory standards institute انجام دادند که حداقل غلظت مهاری به ونکومایسین با روش AB E.test biodisk soluaانجام گرفت. پس از آزمایشهای صورت گرفته مشخص شد که مقاومت انتروکوکوس فکالیس به اریترومایسین در 56 سویه(52.8 )و سیپروفلوکساسین در 43 سویه(40.6) و به جنتامایسین در 41 سویه (32) پنی سیلین در 31سویه (29.2) و به نیتروفورانتویین20 سویه (18.8) ایمی پنم در 11 سویه (10.4) و به ونکومایسین در 6 سویه (4.7) میباشد. پس به طور کلی ظهور مقاومت به چند آنتی بیوتیک و میزان مقاومت بالا به ونکومایسین در سویه‌های انتروکوکوس فکالیس شایان توجه بود که مشخص شدبا انجام درمان مناسب عفونت های ایجاد شده توسط انتروکوکها کاهش پیدا کرده است (159).
دکتر فیض آبادی و گروهی از همکاران ایشان در طی سالهای 1382-1379 در بیمارستانهای لبافی نژاد و شهید چمران به بررسی الگوی مقاومت دارویی سویه انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم پرداختند (159). در این تحقیق تعداد 339 سویه انتروکوک از بیماران بستری و سر پایی جدا شد و مورد بررسی قرار گرفت و کلیه سویهها با استفاده از آزمایش‌ها باکتریولوژی و PCR شناسایی‌شده و الگوی مقاومت دارویی آنها با استفاده از روش کربی بائر نسبت به آنتی بیوتیک های پنیسیلین، آمپیسیلین، ونکومایسین و لینزولید تعیین گردید.آنچه در این مطالعه وپژوهش به دست آمد به شرح زیر می‌باشد:
از 339 سویه انتروکوکی،273سویه (77.5) به گونه فکالیس و 66 سویه (22.5) به گونه فاسیوم تعلق داشت. سویه‌های انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم به ترتیب نسبت به آنتی بیوتیکهای آمپیسیلین (13دربرابر77) پنیسیلین (14 دربرابر 95) سیپروفلوکساسین (57 دربرابر 80) نیتروفورانتوئین در برابر 54) ایمیپنم (3 در برابر 83) وکلرآمفینیکل( 5 در برابر20) مقاوم بودند. در نتیجه با دست یافتن به این داده ها مشخص گردید که با افزایش فراوانی سویه‌های (HLGR) اثر سینرژی جنتامایسین با گلیکوپپتیدها و بتالاکتامها مهار گردیده وهمین امر منجر به عدم درمان مناسب در بیماران میگردد، همچنین مشخص شد که داروی لینزولید و کینوپریستین/دالفوپریستین توان مقابله با سویه‌های انتروکوکوس فاسیوم مقاوم به چند دارو از جمله سویه‌های مقاوم به گلیکوپپتیدها را در ایران داشته در حالی که مصرف تیکوپلانین در کشور با توجه به حضورژنهای کلاسترvanA قابل تامل می‌باشد.
دکتر طالبی و همکارانش طی سال های87- 1386مطالعهای به منظور بررسی مقاومت انتروکوک ها به جنتامایسین انجام دادند، که این مطالعه افراد سالم شهر تهران را در بر میگرفت (160). در این مطالعه از نمونه مدفوع داوطلبین سالم غیر بستری در شهر تهران استفاده گردید که پس از غنی سازی در محیط Brain hearth in fusion broth، بر روی محیط-mانتروکوکوس کشت داده شد. پس از شناسایی گونه ها، MIC سویه ها به جنتامایسین تعیین گردید و دیگر سویه‌های مقاوم در مقابل 8 آنتی بیوتیک مختلف با روش دیسک دیفوژن آگار بررسی گردید.در این پژوهش، بررسی مولکولی مقاومت به جنتامایسین در سویه‌های مقاوم، با روش PCR صورت پذیرفت. نتایج به دست آمده به شرح زیر است: از 500 نمونه مدفوع در 76 (%2/15) نمونه انتروکوک مقاوم به سطح بالای جنتامایسینMIC500mg/mc جدا سازی گردید. که این گونههای جداسازی شده عبارت بودند، از45 (%9/52) سویه انتروکوکوس فکالیس، 29 (%1/38) سویه انتروکوکوس فاسیوم و2 (7/2%) سویه انتروکوکوس گالیناروم بودند. از 11 الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی مشاهده شده تمامی سویه ها دارای ژن مقاومتaac.(6)-aph(25) بودند.به عبارت دیگر ژن اصلی و شاخص ایجاد کننده مقاومت به جنتامایسینaac(6)-aph(2 5)شناخته شده است.(160)
در انستیتو پاستور ایران، دکتر مهناز سیفی و دیگر همکاران (1387) مطالعات خود را بر روی کلونالیتی سویه‌های انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم مقاوم به مقادیر بالای جنتامایسین جدا شده از فاضلاب های شهر تهران انجام دادند (161). از آنجا که انتروکوکها جز فلور نرمال روده هستند پس یکی از روشهای بررسی جمعیت
انتروکوکی، غربالگری فاضلابها از حیث وجود انتروکوکها می‌باشد. هدف از این مطالعه بررسی کلونالیتی در بین سویه‌های HLGR انتروکوکی جدا شده از فاضلاب های تهران بوده است و در این پژوهش و مطالعه از تعداد 140 ایزوله از سه تصفیه خانه فاضلاب در مناطق مختلف شهر تهران در محدوده زمانی آذر ماه 85 تا اردیبهشت 86 بررسی انجام گرفت. تعیین جنس و گونه ایزولهها و ژنهای مقاومت به جنتامایسین توسط روش PCR وتست حساسیت آنتی بیوتیکی وMIC از روش استاندارد CLSI به انجام رسید و همچنین روش Biochemical finger printing (phptyping) باهدف تایپینگ سویه‌های HLGR بکار رفت و در کل نتایج زیر به دست آمد:
انتروکوکوس فکالیس 26 و انتروکوکوس فاسیوم 74 شایعترین گونههای جدا شده از نمونههای فاضلاب بودند. بالاترین میزان مقاومت آنتی بیوتیکی در بین سویه‌های فاسیوم نسبت به اریترومایسین و در بین سویه‌های فکالیس نسبت به تتراساکلین دیده شد. حضور ژن aac(6)-Ie aph(2′ 5)-Iaدر اکثریت ایزوله هایHLGRنشان دهنده انتشار وسیع این ژن درجمعیت انتروکوکی است. شیوع متنوع کلونال در جمعیت انتروکوکهای HLGR و چند مقاومتی در فاضلاب تهران نشان دهنده نقش احتمالی فاضلابها در این سویهها در جامعه ها می باشند (161).
در واحد آسیب شناسی بریتیش کلمبیا، کانادا دکتر Grabsch و همکارانش به شناسایی گونههاو الگوهای مقاومت آنتی بیوتیک انتروکوکی برروی بیماران عفونی میکروبی در سال 1991پرداختند. که در آن140 ایزوله جداسازی شده که این ایزولهها با به کار گیری کارت GPI (سیستم های وتیک) و یک طرح بیوشیمیایی متعارفی مشخص گردید.در این تحقیق مشخص شدکه مقاومت به آمپی سیلین در9/2 ایزوله ها وجود داشته و هیچ تولید کننده بتالاکتامازی در این سویه ها وجود نداشته است.همچنین مقاومت به وانکومایسین مشاهده نشد، اما 1/12 ایزوله ها مقاومت بالا رابه جنتامایسین نشان دادند (164).
در سال 1961 Grabsch به همراه دیگر همکارانش به مطالعه در رابطه با عفونت های انتروکوکی پرداخت. به دلیل اینکه انتروکوک ها به عوامل ضد میکروبی دیواره سلولی فعال هستند، درمان باکتریایی آنها وابسته است به این عوامل در ترکیب با آمینوگلیکوزید، و برای آندسته از نمونه هایی که مقاومت به آمینوگلیکوزیدها را نشان نمی دهند، تریپتومایسین یا جنتامایسین در ترکیب با پنیسیلین، آمپی سیلین یا وانکومایسین قابل استفاده می‌باشد.
و درمان برخی از عفونتهای جدی به دلیل مقاومت بالای باکتری به هر دوآنتی بیوتیک جنتامایسین واسترپتومایسین امکان پذیر نمی باشند.ودراین شرایط انتظار درمان با وانکومایسین و یا آمپی سیلین در این دسته از بیماران وجود نداشت. همچنین در بررسی عوامل ضد میکروبی نتایج زیر به دست آمد: از 195 سویه (6/82) و از 38 سویه (1/16) ایزوله ها به ترتیب به عنوان انتروکوکوسهای جداشده از مدفوع مشخص گردید که در کل 27 نمونه (2/63) از انتروکوکوس های رودهای به آمپی سیلین مقاوم بودند اما هیچ نمونه انتروکوکهایی که از مدفوع جدا شده اند، به آمپی سیلین مقاوم نبود

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *