میکروسکوپ اندازه گیری شد.

2-12-5-تعیین گروه های آناستوموزی جدایه ها
در خصوص تعیین و برقراری پیوند آناستوموزی چهار حالت مورد ارزیابی قرار گرفت. در این راستا، در حقیقت جفت نمودن جدایه های مرجع با جدایه های نامعلوم می باشد که روی لام های استریل، یک لایه ی نازک از محیط آب آگار قرار داده شد. دیسک های 5 میلی متری از حاشیه ی پرگنه ی در حال رشد از جدایه های مرجع آناستوموزی و جدایه های نامعلوم به فاصله ی 2 سانتی متر از هم، روی لام مقابل هم قرار داده شد. بعد از 48-18 ساعت ناحیه ی تماس ریسه ها توسط محلول های رنگی ( آنیلین بلو، تری پان بلو و کاتن بلو) رنگ آمیزی شد و زیر میکروسکوپ بررسی گردید. برای این که جدایه ی نامعلوم در یک گروه مشخص آناستوموزی قرار گیرد از روش به کار رفته توسط کارلینگ و همکاران (1988) استفاده شد. که در آن بیان وقوع الحاق ریسه بین دو جدایه، مجموع نقاط الحاقی و مجموع نقاط تماس در 15 میلی متر سطح میکروسکوپی می باشد. نحوه ی برقراری ریسه پیوندی بین جدایه ها به شرح ذیل در چهار حالت مشخص شده که شامل:
الف- فاقد هر گونه عکس العمل، یعنی این که ریسه های هر دو قارچ بدون هیچ گونه واکنشی در محل برخورد از کنار یکدیگر گذر می کنند که اصطلاحا به آن C0 گفته می شود.
ب- واکنش C1 که در این جا فقط به تماس ریسه ها محدود می شود که معمولا بین دو جدایه اتفاق می افتد که به گروه آناستوموزی مشابه و یا متفاوت تعلق دارند.
ج- واکنش C2 که در این واکنش ریسه های دو جدایه با گروه آناستوموزی یکسان صورت گرفته که الحاق دیواره ای بین دو ریسه ی مربوط به دو جدایه ی متقابل رخ می دهد که در این نوع رابطه معمولا یاخته های محل آناستوموزی و سلول ها از بین می روند.
د- واکنش C3 حالتی است که بین ریسه های مربوط به یک جدایه از گروه های آناستوموزی و با ژنوتیپ یکسان به وقوع می پیوندد. در این جا بر خلاف قبل موقعیت مکانی آناستوموزی مبهم و نامشخص بوده و قطر ریسه در گروه آناستوموزی مساوی با قطر ریسه با بقیه ی نقاط می باشد و معمولا یاخته های محل آناستوموزی و نیز یاخته های مجاور قالبا پایدار بوده و از بین نمی روند.

2-12-6-اثبات بیماری زایی
آزمون بیماری زایی با تهیه ی غده های یک و یا چند رقم موجود با ضد عفونی سطحی در گلدان های حاوی خاک سترون کاشته شد و چهار الی پنج قطعه به قطر 5 میلی متر از حاشیه پرگنه 7 الی 10 روزه قارچ در محیط کشت PDA، در اطراف غده ها قرارداده شدند سپس با حدود 5 سانتی متر مکعب خاک پاستوریزه مرطوب پوشانده شدند. بعد ازگذشت سه هفته آبیاری مرتب ساقه ها به آرامی از خاک داخل گلدان ها بیرون آورده شدند، خاک اطراف آن ها شستشو شده و میزان ضایعه حاصل از جدایه ی قارچی روی آن ها بر اساس سیستم درجه بندی کارلینگ انداره گیری گردید.

2-12-6-1-تعیین درصد آلودگی
برای تعیین درصد آلودگی، با جمع آوری غده ها از هر تکرار تعداد 20 عدد غده یک نواخت از نظر اندازه جدا و با آب معمول شستشو شده تا بیماری شوره سیاه روی غده ها به وضوح قابل مشاهده گردد و تعداد غده های آلوده و سالم به تفکیک شمارش و درج گردید.
درخصوص بیماری شانکر خشک ریزوکتونیائی، در هر مرحله حداقل 100 بوته از هر تکرار مطالعه گردید. بدین صورت که اقدام به خارج کردن بوته ها از خاک کرده، به طوری که هیچ گونه ضربه ای به ریشه و ساقه زیرزمینی آن ها وارد نگردد، سپس بوته های مورد آزمون پس از شستشو و خشک کردن، به طورجداگانه ای مطالعه گردید و تعداد ساقه های آلوده و سالم به تفکیک شمارش و درج گردید.

2-12-6-2-تعیین شدت بیماری
شدت بیماری به بیماری شوره سیاه، براساس دیاگرام های توصیفی انسیتوی ملی گیاه شناسی کشاورزی انگلیس موسوم به NIAB (National Institute of Agriculture Botany) درقسمت بیماری ها (Anon,1985) به شرح زیر استفاده گردید:
سالم بودن سطح غده (0)
پیدایش شوره سیاه کم قابل اندازه گیری ( 10)
پیدایش 25 درصدی سطح غده توسط شوره سیاه ( 25 )
پیدایش 50 درصدی سطح غده توسط شوره سیاه ( 50 )
پیدایش 75 درصدی سطح غده توسط شوره سیاه ( 75 )
پوشش کامل غده وسیاه شدن آن ( 100 )

شکل2-1: شاخص بیماری شوره سیاه برحسب شدت و ضعف بیماری روی غده گیاه سیب‌زمینی(Anon., 1985)

شدت بیماری به بیماری شانکر خشک ریزوکتونیایی، نیز بر اساس سیستم درجه بندی کارلینگ در پنج شاخص متفاوت شامل صفر (هیچ گونه آلودگی)، یک (آلودگی جزیی با لکه های کمتر از 5 میلی متر روی جوانه ها)، دو (آلودگی با لکه های بیشتر از 5 میلی متر و حلقه ای شدن در برخی از جوانه ها)، سه (آلودگی بالا با پدیدار شدن لکه های بزرگ و حلقه ای شدن لکه ها همراه با مرگ اکثر جوانه ها) و چهار (از بین رفتن کلیه ی جوانه ها) اندازه گیری شد.

مطلب مشابه :  منابع تحقیق با موضوععرضه کننده، عرضه و تقاضا، ارزش بازار، ساختار بازار

شکل2-2-: شاخص بیماری شانکر خشک برحسب شدت و ضعف بیماری روی ساقه گیاه سیب‌زمینی
(Carling & leiner, 1990)

2-12-6-3-تعیین شاخص بیماری
برای تعیین شاخص بیماری، شدت های مربوط شامل 0، 10، 25، 50، 75، 100 در مقابل باضرایب 0،1، 2، 4، 8، 16 ضرب و سپس جمع و تقسیم بر تعداد کل غده های مورد بررسی در خصوص شوره سیاه و تعداد کل ساقه های مورد بررسی در خصوص شانکر خشک قرار گرفت. لذا، شاخص مربوطه در طیف 16- 0 تعیین گردید (Anon, 1985).

2-12-7- بررسی جدایه های Rhizoctonia از استولون های سیب زمینی و اثبات بیماری زایی آن ها بر روی گونه های گیاهی دیگر
برای این منظور از استولون ها و ساقه های آلوده نمونه هایی از مناطق مختلف استان های اصفهان، همدان، اردبیل، فارس، کرمان(جیرفت) و کردستان(سنندج) ج
مع آوری شدند و پس از به دست آوردن جدایه ها از نمونه های مذکور، مطالعات بیماریزایی بر روی طالبی، گوجه فرنگی، فلفل و چغندر انجام گردید. برای انجام این آزمایش بذور با هیپو کلریت سدیم %5/0 به مدت 2 دقیقه ضد عفونی شدند. سپس بذرها به مدت 24 ساعت درون پارچه ای نم دار قرار گرفتند و پس از خارج کردن در درون گلدان با لایه ای خاک مخلوط با اینوکلوم پوشانده شدند، و گلدان ها نیز بطور معمول آبیاری شدند.
در انتها پس از 14 روز گونه های گیاهی از گلدان ها خارج شدند و علایم و میزان خسارت آن ها اندازه گیری شد. خصوصیات اندازه گیری شامل اندازه ی ریشه، اندازه ساقه، وزن تر و وزن خشک بوته می باشد.
2-13-تجزیه و تحلیل آماری
تجزیه ی واریانس برای کلیه ی صفات آلودگی به صورت آزمایش ساده و مرکب در کلیه‌ی مراحل و برای هر دو بیماری و در خصوص هر سه فاکتور درصد آلودگی، شدت بیماری و شاخص بیماری بررسی و انجام گردید. مقایسه ی میانگین اثرات ساده و متقابل صفات مورد مطالعه به وسیله ی آزمون چند دامنه ی دانکن (DMRT)در سطح احتمال 5 و یک درصد و تجزیه ی خوشه ای به روش وارد انجام که همگی با استفاده از نرم افزارSAS وSPSS تجزیه شده است.

2-14-بررسی تنوع ژنتیکی جدایه ها
ارزیابی تنوع ژنتیکی به منظور آگاهی از پراکنش جغرافیایی و هم چنین کسب اطلاعات لازم برای مدیریت بیماری و ایجاد ارقام مقاوم اهمیت دارد. به علاوه به توصیف موقعیت تاکسونومی و روابط اپیدمیولوژیکی عامل بیماری کمک می کند. با توجه به اهمیت موضوع، بررسی هایی در سطح کشور در خصوص تفاوت جدایه ها در شرایط آزمایشگاه و نیز تنوع ژنتیکی آنها انجام گردید که در این جهت از روش مولکولی RAPD که روشی ساده و سریع بوده و نیازی نیز به اطلاعات اولیه در مورد توالی DNA برای طراحی و ساخت آغازگر ندارد استفاده شد. لذا، با توجه به موارد فوق به نظر می‌رسد که بررسی تنوع ژنتیکی درون گونه‌ای عامل بیماری گونه ی R. solani یک امر ضروری باشد تا وضعیت ژنتیکی آن ها بر حسب منطقه بررسی و تفکیک شود. در این راستا، جدایه‌های مربوطه در سطح آزمایشگاه بر اساس PCR با مارکرهای مولکولی RAPD با یک دیگر در قالب یک طرح تحقیقاتی روی حدود 300 جدایه در استان های اصفهان، فارس، همدان و اردبیل مقایسه شدند. لذا باندهای مشاهده شده روی ژل، اسکوربندی شد که با استفاده از ضریب تشابه جاکارد انجام گردید.داده های حاصل از بیماری زایی جدایه ها پس از تجزیه های آماری با داده های ژنتیکی مقایسه و از نظر آماری هم بستگی آن ها بررسی و محاسبه گردید. تفاوت ژنتیکی درون و برون گونه ای قارچ های بیماری زای گیاهی، سبب توسعه ی تخصص بیماری زایی و مقاومت به قارچ کش ها می شود و در بیماری شناسی گیاهی مورد توجه قرار گرفته است.

بدین منظور مطالعات ژنتیکی به شرح مراحل ذیل انجام شد.
1-خالص سازی جدایه های R. solani از مزارع سیب زمینی با استفاده از محیط کشت PDA .
2-کشت جدایه های قارچ عامل بیماری داخل محیط کشت مایع به منظور تولید میسلسوم انبوه.
3-استخراج DNA از جدایه ها و انجام PCR با استفاده از آغازگرهای RAPD، الکتروفورز و مقایسه باندها.
4-آنالیز داده های حاصل از الکتروفورز و گروه بندی جدایه ها با استفاده از نرم افزار SPSS و NTSYS-pc .
2-14-1-خالص کردن جدایه ها
برای انجام آنالیزهای مولکولی ابتدا بایستی جدایه ها خالص شوند. این کار با کشت مجدد روی محیط PDA انجام شد.
2-14-2- تولید انبوه میسلیوم
برای تولید میسلیوم، در محیط کشت مایع کشت داده شد. بدین منظور محیط کشت های مختلف، شامل محیط کشت مایع نیمه سنتتیک استفاده گردید(زمانی و همکاران 1368 و صفایی و همکاران 1378).به منظور تهیه توده میسلیوم مورد نیاز جهت استخراج DNA ژنومی از روش رومین و همکاران استفاده گردید(1999.(Romain et al .,
ابتدا محیط غذایی که شامل عصاره سیب زمینی در آب (حاوی 15 گرم دکستروز و 200 گرم سیب زمینی در یک لیتر آب مقطر) تهیه گردید. مقدار 40 میلی لیتر از محیط غذایی مذکور ارلن مایر های 100 میلی لیتری ریخته شد و درب آن ها با پنبه استریل بسته شد. پس از استریل نمودن محیط غذایی، هر یک از ارلن ها توسط سه دیسک به قطر پنج میلی متر، که از حاشیه پرگنه در حال رشد جدایه مورد نظر تهیه می گردید، مایه زنی شدند.ارلن های مایه زنی شده بر حسب سرعت رشد جدایه ها، به مدت 2 الی 4 روز بر روی شیکر با سرعت 120 دور در دقیقه قرار داده شدند. پس از طی مدت زمان لازم، برای برداشت توده میسلیومی از پمپ خلاء و شستشو با آب مقطر استریل استفاده گردید. میسلیوم های خشک شده در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.

مطلب مشابه :  مقاله رایگان با موضوعانسان سالم

2-14-3-استخراج DNA
از آنجایی که روش RAPD روش بسیار حساسی است و میزان خلوص DNA در صحت، دقت و تکرارپذیری نتایج به دست آمده تاثیر به سزایی دارد، برای استخراج DNA مقدار 5/0 گرم از توده ی میسلیومی هر یک از جدایه های مورد مطالعه که در دمای 80- در جه سانتی گراد نگه داری شده بود، درون هاون قرار داده شد. سپس حدود 500 میکرولیتر بافر CTAB به آن اضافه گردید. مخلوط حاصل به میکروتیوب اپندورف 5/1 میلی لیتری منتقل شد و میکروتیوب ها به مدت 30 دقیقه در حمام آب گرم 60 درجه سانتی گراد نگهداری شدندو برای تاثیر بهتر بافر بر میسلیوم های پودر شده هر 15 دقیقه یکبار مخلوط سر و ته می شد.در این مرحله در حضور بافر، دیواره سلولی قارچ متلاشی و محتویات داخل سلول خارج می شوند. سپس نمونه ها پنج دقیقه روی یخ قرار گرفتند. سپس 600 میکرولیتر کلروفرم به هر میکروتیوب اضافه گردید و با دست به مدت 5 دقیقه تکان داده شدند. سپس به مدت 10 د
قیقه در دور 13000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد در دستگاه سانتریوفوژ قرار گرفتند.مقدار 400 میکرولیتر از مخلوط حاصل به لوله جدید 1.5 میلی لیتری منتقل شد و متعاقبا 400 میکرولیتر کلروفرم به هر میکروتیوب اضافه گردید و به مدت 10 دقیقه در 13000 دور در دقیقه سانتریوفوژ گردیدند. مقدار 300 میکرولیتر از رونشین مخلوط به میکروتیوب جدید 1.5 میلی لیتری منتقل شد. سپس به منظور رسوب دادن DNA مقدار 600 میکرولیتر اتانول مطلق سرد به هر میکروتیوب اضافه گردید و مجددا 15 دقیقه در 13000 دور در دقیقه سانتریوفوژ گردیدند. پس از طی این مدت محتویات میکروتیوب ها دور ریخته شد. مجددا برای شستشوی DNA مقدار 300 میکرولیتر اتانول 70% به هر میکروتیوب اضافه شد.سپس میکروتیوب ها به مدت 10 دقیقه در 13000 دور سانتریوفوژ گردیدند. پس از طی این مدت، محتویات میکروتیوب ها دور ریخته شد و میکروتیوب ها به صورت واژگون روی دستمال کاغذی تمیز قرار داده شدند تا قطرات اضافی درون آن حذف شوند. نهایتا 50 میکرولیتر آب مقطر استریل به هر میکروتیوب اضافه گردید و میکروتیوب ها به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد روی هیتر نگهداری و سپس به درون فریزر با دمای 20- درجه سانتیگراد منتقل شدند.
DNA استخراج شده به روش اسپکتروفتومتری و ژل آگارز مورد ارزیابی قرار گرفت. برای بررسی DNAاستخراج شده از نظر کمی و کیفی، مقدار پنج میکرولیتر از DNA را با یک میکرولیتر بافر نمونه مخلوط وبا استفاده از آگارز 0.8% الکتروفورز شد. به منظور بررسی وضعیت DNA استخراج شده از نظر غلظت و مواد همراه آن شامل پروتئین ها و پلی ساکارید هااز دستگاه اسپکترو فتومتر استفاده شد. در این روش 2 میکرولیتر از محلول DNA با 98 میکرولیتر آب مقطر استریل مخلوط شد. سپس غلظت DNA در طول موج 260 و 280 نانومتر و همچنین نسبت این دو قرائت شد.
برای آماده سازی مخلوط PCR، تکثیر DNA در حجمی معادل 25 میکرولیتر انجام شد. برای این منظور، ابتدا مواد فوق به غیر از DNA در یک میکروتیوب سترون 1.5 میلی لیتری مخلوط شدند و مخلوط حاصل به مدت 3 ثانیه با ورتکس به هم زده شد تا مواد به خصوص آنزیم DNA پلی مراز به خوبی مخلوط شوند.
تعداد واکنش بستگی به تعداد DNA دارد. معمولا به جهت خطای میکروپیپت ها بسته به تعداد واکنش، حجم واکنش بیشتر از حجم مورد نیاز تهیه می گردد. بهتر است تهیه مخلوط واکنش PCR روی یخ انجام گیرد. در مرحله بعد به کمک میکروپیپت 24 میکرولیتر از مخلوط فوق به میکروتیوب های 0.2 میلی لیتری منتقل گردید. سپس یک میکرولیتر از DNA ژنومی هر نمونه به کمک میکروپیپت های 10 میکرولیتری به مخلوط درون هر تیوب PCR اضافه گردید.
در نهایت میکروتیوب ها در هر چاهک دستگاه PCR قرار داده شدند. سپس برنامه حرارتی برای واکنش های PCR و تکثیر قطعات DNA بسته به نوع نشانگر و آغازگر تنظیم گردید.

جدول(2-3): مقدار مواد استفاده شده برای هر واکنش PCR
حجم (میکرولیتر)
غلظت نهایی
نام ماده
7.67

DPTH Water
1
2 mM
MgCl2(50mM)
2.5
1X
PCR Buffer (10X)
0.25
0.2 mM
dNTPs Mixture (20mM)
0.75(15x)=11.25
0.3?M
Primers(10mM)
0.33
1.


دیدگاهتان را بنویسید